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限制酶切割失敗原因 在 [問題]限制酵素切不動質體可能的原因是??? - 精華區Biotech 的美食出口停車場
最近這2.3週
我的實驗室出現了一個奇怪的問題
包括我以及學弟妹挑轉殖ligation產物的E.coli.
做大量培養後
抽出來的質體(alkaline lysis,就是傳統的那一種抽法,"沒有"通SV column)
會有幾隻菌的質體限制酵素切不動
(我們每個人使用的限制酵素都不同,所以應該不是酵素的問題)
切不動的質體跑膠出來的supercoiled band
比原本載體的supercoiled band還要小一點
我問過老師
老師說這可能是質體被modified
他說XL1-Blue有這樣的問題
但是我們實驗室的勝任細胞都是個人養個人的
而且學弟的品種還是商業化的勝任細胞(DH5alpha)
所以我想可能不是菌種的原因
列一下我自己想到的原因
也請大家幫我想想看還有什麼可能性或是解決的辦法好嗎???拜託了...
1. solII,solIII的pH值有誤,使質體DNA復性的狀況被破壞
2. 抽好地質體鹽類太多,造成DNA產生一些2級結構
3. ...
麻煩大家了...謝謝
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發信人: [email protected] (恆星的恆心), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題]限制酵素切不動質體可能的原因是???
發信站: 陽明大學神農坡資訊站 (Sat Dec 3 02:25:24 2005)
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> 也請大家幫我想想看還有什麼可能性或是解決的辦法好嗎???拜託了...
> 1. solII,solIII的pH值有誤,使質體DNA復性的狀況被破壞
> 2. 抽好地質體鹽類太多,造成DNA產生一些2級結構
> 3. ...
> 麻煩大家了...謝謝
用什麼enzyme切呢 可不可以說一下呢
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所有你想的到的enzyme都切不動嘛???
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勇氣的 Ella 陳嘉樺 ╔╦═╮╔╗ ╔╗ ╭══╮
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發信人: [email protected] (Arsenic), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題]限制酵素切不動質體可能的原因是???
發信站: 批踢踢參 (Sat Dec 3 12:31:02 2005)
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※ 引述《[email protected] (蓄勢待發)》之銘言:
: 最近這2.3週
: 我的實驗室出現了一個奇怪的問題
: 包括我以及學弟妹挑轉殖ligation產物的E.coli.
: 做大量培養後
: 抽出來的質體(alkaline lysis,就是傳統的那一種抽法,"沒有"通SV column)
: 會有幾隻菌的質體限制酵素切不動
:
Sometimes certain strain tend to methylate their DNA, for example, XbaI will be
ineffective when JM109 is used. JM110, on the other hand, defected in methylation
and thereby can be digested.
--
※ 發信站: 批踢踢參(ptt3.cc)
◆ From: 141.217.223.179
> -------------------------------------------------------------------------- <
作者: pwl (蓄勢待發) 看板: Biotech
標題: Re: [問題]限制酵素切不動質體可能的原因是???
時間: Sat Dec 3 17:51:22 2005
※ 引述《[email protected] (Arsenic)》之銘言:
: ※ 引述《[email protected] (蓄勢待發)》之銘言:
: : 最近這2.3週
: : 我的實驗室出現了一個奇怪的問題
: : 包括我以及學弟妹挑轉殖ligation產物的E.coli.
: : 做大量培養後
: : 抽出來的質體(alkaline lysis,就是傳統的那一種抽法,"沒有"通SV column)
: : 會有幾隻菌的質體限制酵素切不動
: Sometimes certain strain tend to methylate their DNA, for example, XbaI will be
: ineffective when JM109 is used. JM110, on the other hand, defected in methylation
: and thereby can be digested.
重po圖片...
https://www.wretch.cc/album/show.php?i=pwl&b=1&f=1133615650&p=0
是我的錯,寫的不清不楚
這樣寫應該有比較清楚了~~
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◆ From: 140.130.98.42
※ 編輯: pwl 來自: 61.57.219.221 (12/03 21:20)
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發信人: [email protected] (恆星的恆心), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題]限制酵素切不動質體可能的原因是???
發信站: 陽明大學神農坡資訊站 (Sat Dec 3 18:36:02 2005)
轉信站: ptt!Group.NCTU!grouppost!Group.NCTU!YM
> : and thereby can be digested.
> 我po一下圖片喔...
> https://www.wretch.cc/album/show.php?i=pwl&b=1&f=1133602546&p=0
> 從圖來看的話,切不動的這些質體的大小好像也怪怪的
> 請問如果是被甲基化的話,也會造成在膠體的位置發生改變嗎???
他說的不是說在gel上面會有改變 而是指連切都不會切動喔
因為enzyme碰到methylation site就沒辦法切動
然後我看了一下你po的圖 我想問你一下在marker左邊那三條是vector control嘛??
還有你備註裡頭寫的"這些plasmid所形成的超螺旋band比載體的超螺旋band還小"
是指的是你說的2 3 4 7的lane嘛???
如果假設你的marker是10kb,8kb,6kb,5kb,4kb,3kb......的話....(我猜的)
你是說你的那四個lane下面那一條band是 supercoil form嘛???
可是我看的感覺不太像耶....能不能找一個切一刀的enzyme(in vector)切完在給我看看呢
多謝多謝
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發信人: [email protected] (Arsenic), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題]限制酵素切不動質體可能的原因是???
發信站: 批踢踢參 (Sat Dec 3 21:51:15 2005)
轉信站: ptt!Group.NCTU!grouppost!Group.NCTU!ptt3
※ 引述《[email protected] (蓄勢待發)》之銘言:
: ※ 引述《[email protected] (Arsenic)》之銘言:
: : Sometimes certain strain tend to methylate their DNA, for example, XbaI will be
: : ineffective when JM109 is used. JM110, on the other hand, defected in methylation
: : and thereby can be digested.
: 我po一下圖片喔...
: https://www.wretch.cc/album/show.php?i=pwl&b=1&f=1133602546&p=0
: 從圖來看的話,切不動的這些質體的大小好像也怪怪的
: 請問如果是被甲基化的話,也會造成在膠體的位置發生改變嗎???
It seems that methylation is not the culprit. If I were you, I will try other
restriction enzyme (one cut) to digest your samples as well as control to
check their size. Also check the sequence if the cutting site is gone after
your blunt end ligation. If necessary, sequence the entire multiple cloning
site(polylinker). Good luck.
--
※ 發信站: 批踢踢參(ptt3.cc)
◆ From: 141.217.223.179
> -------------------------------------------------------------------------- <
作者: erp44 (林老師) 看板: Biotech
標題: Re: [問題]限制酵素切不動質體的原因是?(圖重po)
時間: Sun Dec 4 00:49:24 2005
※ 引述《pwl (蓄勢待發)》之銘言:
: ※ 引述《[email protected] (Arsenic)》之銘言:
: : Sometimes certain strain tend to methylate their DNA, for example, XbaI will be
: : ineffective when JM109 is used. JM110, on the other hand, defected in methylation
: : and thereby can be digested.
: 重po圖片...
: https://www.wretch.cc/album/show.php?i=pwl&b=1&f=1133615650&p=0
: 是我的錯,寫的不清不楚
: 這樣寫應該有比較清楚了~~
OK, I got it!
Your Problem:
KpnI常常不work(NEB的品質有問題)
所以
常作cloning的lab會用Acc65I來切KpnI site!!!
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 134.76.215.199
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: [email protected] (恆星的恆心), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題]限制酵素切不動質體的原因是?(圖重po)
發信站: 陽明大學神農坡資訊站 (Sun Dec 4 01:21:47 2005)
轉信站: ptt!Group.NCTU!grouppost!Group.NCTU!YM
> : 這樣寫應該有比較清楚了~~
> OK, I got it!
> Your Problem:
> KpnI常常不work(NEB的品質有問題)
> 所以
> 常作cloning的lab會用Acc65I來切KpnI site!!!
上一位說的沒有錯 KpnI的確很難切 有時候的確要換成Acc65I
不過我看起來 還是應該要找一個只有在insert有一刀 或是只有在vector有一刀的
切切看 因為感覺起來那不太像是supercoiled form耶....
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勇氣的 Ella 陳嘉樺 ╔╦═╮╔╗ ╔╗ ╭══╮
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※ Origin: 陽明神農坡 <bbs.ym.edu.tw> ◆ From: 140.129.74.7
> -------------------------------------------------------------------------- <
作者: erp44 (林老師) 看板: Biotech
標題: Re: [問題]限制酵素切不動質體的原因是?(圖重po)
時間: Sun Dec 4 03:18:37 2005
※ 引述《[email protected] (恆星的恆心)》之銘言:
: > OK, I got it!
: > Your Problem:
: > KpnI常常不work(NEB的品質有問題)
: > 所以
: > 常作cloning的lab會用Acc65I來切KpnI site!!!
: 上一位說的沒有錯 KpnI的確很難切 有時候的確要換成Acc65I
: 不過我看起來 還是應該要找一個只有在insert有一刀 或是只有在vector有一刀的
: 切切看 因為感覺起來那不太像是supercoiled form耶....
下列可以同時進行:
1. 2 3 4 7可以用Acc65I再切一遍
2. 可以用PCR來Check
3. 重抽
*不知道你ligation做得如何,有沒有做 negative control比較一下co
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◆ From: 134.76.215.199
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作者: cutilis (突然發覺志燮好幸福) 看板: Biotech
標題: Re: [問題]限制酵素切不動質體的原因是?(圖重po)
時間: Mon Dec 5 17:15:31 2005
你說有insert的質體以酵素切完會有三條band:0.2, 0.8, 4.2
我覺得這邊怪怪的ㄟ..... 請問你原本質體的該酵素切位是在第幾個bp的地方?
然後該酵素在inset上的切位又是在哪個位置呢'?
你可以試著用環狀質體圖表達酵素在質體上的位置嗎?
因為如果照你說該酵素在原來質體上有一個切位,並且在insert上有兩個切位,
那在有接insert的轉殖質體上,在切完之後的位置不太可能是4.2和0.2, 0.8才是
除非說,你的切位一個剛好是在原本質體的3'端或是5'端, 然後在insert上的位置也剛好位
於3'或是5'端.
下面是我化的的示意圖,您的是哪一種ㄌㄟ?
因為我在想或許是我會錯意,或是其實您有切動.....
https://www.wretch.cc/album/show.php?i=wensan0000&b=2&f=1133774052&p=0
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